亮文解读 | 使用基于结构的药物设计方法发现喹喔啉-三酮类HPPD抑制剂

粮食安全是关系到国民经济可持续发展和社会稳定的国家战略，除草剂在确保粮食安全方面发挥着不可替代的作用。然而，由于近几十年来除草剂的不合理和过度使用，杂草的抗性发展呈现集中爆发趋势。因此，为了满足市场需求，迫切需要开发具有新作用机制的除草剂，以有效克服当前杂草对除草剂的抗性问题。

对羟基苯丙酮酸双加氧酶（HPPD）是一种含Fe(II)的非血红素加氧酶，参与酪氨酸的代谢过程，将天然底物对羟基苯丙酮酸（HPPA）转化为尿黑酸，植物体内的尿黑酸被代谢为光合作用途径的重要前体——质体醌和生育酚。当HPPD被抑制时，光合作用受阻导致植物白化死亡。以HPPD为靶标的除草剂具有高效、低毒、杀草谱广、抗性风险低等优点，并且与其他除草剂不存在交互抗性，因而对一些抗性杂草表现出极好的防治效果。鉴于此，HPPD类除草剂可能为未来的抗性杂草管理提供优选的解决方案，发现多类型的超高效HPPD抑制剂活性分子，将有利于除草剂行业的可持续发展。

本文利用基于结构的药物设计（SBDD）方法，基于所在研发团队前期解析的AtHPPD与硝磺草酮复合物晶体（PDB ID：5YWG，图1），发展了新型HPPD抑制剂的合理设计方法。复合物晶体结构显示，硝磺草酮的三酮环与催化位点的金属离子形成双齿螯合，苯环与Phe424和Phe381形成π-π堆积作用，这两种相互作用是硝磺草酮与靶标结合的关键。基于此，我们保留三酮片段与AtHPPD的重要螯合方式，同时在三酮部分连接具有良好生物活性的π-共轭杂环骨架（喹喔啉）以加强π-π相互作用，提高分子与HPPD的亲和力，设计了一种喹喔啉-三酮的母核结构（结构A，如图1所示）；在母核侧链引入疏水性苯环，以联苯或二苯醚的形式与喹喔啉的C-8位点相连，增强化合物与疏水残基的相互作用，设计了两种潜在的新型HPPD抑制剂（7a–7j和7k–7q）。

图1 新型喹喔啉-三酮类HPPD抑制剂7a–7q的分子设计策略

▎合成部分

喹喔啉-三酮衍生物7a–7q通过七步反应合成，如图2所示。以4-氨基-3-硝基苯甲酸（化合物1）为原料；经NBS溴化、硝基还原生成3,4-二氨基-5-溴苯甲酸甲酯（化合物3）；化合物3关环得到8-溴-2,3-二甲基喹喔啉-6-羧酸甲酯（化合物4）；化合物4分别通过Suzuki偶联和微波辅助构建联苯-喹喔啉化合物5a–5j和二苯醚-喹喔啉化合物5k–5q；随后与1,3-环己二酮反应得到相应的烯醇酯6a–6q；最后经Fries重排得到目标化合物7a–7q。

(A) NBS，DMF，–5°C；(B) 兰尼Ni/H₂，MeOH， 室温；(C) NH₄Cl，MeOH，回流；(D)  K₃PO₄·3H₂O，Pd(OAc)₂， 回流；(E) DMG·HCl，CuI，Cs₂CO₃，126–130°C，微波；(F)  CMPI，1,3-环己二酮，Et₃N，CH₂Cl₂，室温；(G) Et₃N，丙酮氰醇，CH₃CN，室温；(H) 1 N·HCl

▎酶抑制活性与构效关系研究

在联苯-喹喔啉-三酮衍生物中，化合物7d（IC₅₀ = 0.317 μmol·L⁻¹）、7i （IC₅₀ = 0.353 μmol·L⁻¹）和7n（IC₅₀ = 0.406 μmol·L⁻¹）的酶抑制活性优于硝磺草酮（IC₅₀ = 0.412 μmol·L⁻¹），以化合物7d活性最优。含取代基衍生物比未取代的化合物7a（IC₅₀ = 891 μmol·L⁻¹）更好，当在末端苯基引入甲基时，邻甲基（7d，IC₅₀ = 0.317 μmol·L⁻¹) >对甲基（7b，IC₅₀ = 0.423 μmol·L⁻¹）>间甲基（7c，IC₅₀ = 0.643 μmol·L⁻¹）。当将F或Cl引入苯基时，化合物的活性与甲基取代的衍生物（7b–7d）相当。三氟甲基取代的化合物7i（IC₅₀ = 0.353 μmol·L⁻¹）活性显著优于三氟甲氧基取代的化合物7j（IC₅₀ = 0.823 μmol·L⁻¹）。

多数二苯醚-喹喔啉-三酮化合物具有较好的酶抑制活性，含氟化合物7n（IC₅₀ = 0.406 μmol·L⁻¹）比含氯化合物7o（IC₅₀ = 0.643 μmol·L⁻¹）和7p（IC₅₀ = 0.592 μmol·L⁻¹）的活性更强。苯氧基取代的化合物构效关系可归纳为：4-F（7n，IC₅₀ =0.406 μmol·L⁻¹）> 4-OCF₃（7q，IC₅₀ = 0.460 μmol·L⁻¹）> 4-CH₃（7l，IC₅₀ = 0.533 μmol·L⁻¹）> 4-OCH₃（7m，IC₅₀ =0.565 μmol·L⁻¹）> 3-Cl（7p，IC₅₀ = 0.592 μmol·L⁻¹）> 4-Cl（7o，IC₅₀= 0.643 μmol·L⁻¹）> H （7k，IC₅₀ = 0.791 μmol·L⁻¹）。

▎分子对接模拟

利用分子对接研究了化合物7d与AtHPPD的结合模式（图 3A和图 3B），三酮部分与Fe(II)双齿螯合，喹喔啉骨架与Phe424和Phe381形成π-π堆积作用；侧链的苯环嵌入疏水腔中，和周围的Met335、Leu368和Leu427形成疏水作用，与Phe392形成π-π相互作用。化合物7d的喹喔啉骨架在Phe424和Phe381之间重叠程度比硝磺草酮苯环更大，π-π相互作用更强；以上两种相互作用使化合物7d的靶标结合能力增加。

使用MM-PBSA方法对化合物7d和硝磺草酮进行结合自由能理论计算，定量说明结合能力的差异。如表1所示，7d的结合自由能（∆G_binding = –44.2 kJ·mol⁻¹）低于硝磺草酮（∆G_binding = –33.7 kJ·mol⁻¹），与实验值相符；化合物7d的ΔG_nonpolar（–224.4 kJ·mol⁻¹）明显低于ΔG_polar（134.6 kJ·mol⁻¹），表明配体的疏水相互作用对结合能力非常重要；硝磺草酮的疏水作用（ΔG_nonpolar = –211.0 kJ·mol⁻¹）弱于化合物7d，直接导致其结合能力更差。

本文利用SBDD方法设计了一类新型喹喔啉-三酮HPPD抑制剂，对该类化合物进行合成和AtHPPD抑制活性实验，结果表明喹喔啉-三酮衍生物对AtHPPD具有显著的抑制作用，化合物7d（IC₅₀ = 0.317 μmol·L⁻¹）表现出最优的HPPD抑制作用，优于商用HPPD抑制剂硝磺草酮。分子对接模拟化合物7d在HPPD中的结合模式，从分子层面阐述了化合物与靶标结合的分子机制。综上实验结果和理论研究表明，基于SBDD方法发现新型HPPD抑制剂是一种有效的分子设计策略，同时本文中喹喔啉-三酮衍生物为发现新型HPPD类除草剂提供了一种有研究价值的先导骨架。
 

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