亮文解读 | 基于BSR-seq鉴定梅花垂枝性状关联的一新等位基因

绿色可持续发展之园艺研究

Horticulture Research for Green and Sustainable Development

专 辑 文 章 介 绍

 · 第一篇 · 

▎论文ID

Bulked segregant RNA sequencing (BSR-seq) identifies a novel allele associated with weeping traits in Prunus mume

基于BSR-seq鉴定梅花垂枝性状关联的一新等位基因

期  刊：Frontiers of Agricultural Science and Engineering（FASE）

作  者 :  Xiaokang ZHUO (1,2), Tangchun ZHENG (1,2), Zhiyong ZHANG (1,2), Suzhen LI (1,2), Yichi ZHANG (1,2), Lidan SUN (1,2), Weiru YANG (1), Jia WANG (1), Tangren CHENG (1), Qixiang ZHANG (1,2)

通讯作者 :   Qixiang ZHANG

Correspondence:  zqxbjfu@126.com

1. Beijing Key Laboratory of Ornamental Plants Germplasm Innovation and Molecular Breeding, National Engineering Research Center for Floriculture, Beijing Laboratory of Urban and Rural Ecological Environment, Engineering Research Center of Landscape Environment of Ministry of Education, Key Laboratory of Genetics and Breeding in Forest Trees and Ornamental Plants of Ministry of Education, School of Landscape Architecture, Beijing Forestry University, Beijing 100083, China.

2. Beijing Advanced Innovation Center for Tree Breeding by Molecular Design, Beijing Forestry University, Beijing 100083, China.

Cite this article

Xiaokang ZHUO, Tangchun ZHENG, Zhiyong ZHANG, Suzhen LI, Yichi ZHANG, Lidan SUN, Weiru YANG, Jia WANG, Tangren CHENG, Qixiang ZHANG. BULKED SEGREGANT RNA SEQUENCING (BSR-SEQ) IDENTIFIES A NOVEL ALLELE ASSOCIATED WITH WEEPING TRAITS IN PRUNUS MUME. Front. Agr. Sci. Eng., 2021, 8(2): 196‒214 https://doi.org/10.15302/J-FASE-2020379
 

Highlights

（1）利用BSR-seq方法鉴定出7号染色体上与垂枝性状相关的5个QTLs。
（2）鉴定一新等位基因PmUGT72B3，其编码序列第66个碱基位置发生T(直枝) > C(垂枝)的同义突变，且其在直枝梅启动子序列存在470 bp缺失。
（3）WGCNA分析表明，PmUGT72B3与激素和木质素调控基因密切关联。
 

Graphical abstract

 

文章摘要

垂枝型植物既可用作观赏植物，也可用于培育矮化株型。然而，目前针对控制垂枝性状关键基因的探索相当有限。本研究从直立栽培品种‘柳板’和垂枝栽培品种‘粉台垂枝’的F1双亲作图群体中鉴定到极端表型单株，采用混池转录组测序在7号染色体上鉴定到5个与垂枝性状相关的QTL。其中在与前人报道的QTL区间重叠范围内检测到一个候选基因Pm024074 (PmUGT72B3)，该基因属于包含松柏醇葡萄糖基转移酶结构域的UDP-糖基转移酶超家族成员，其编码序列存在一个T⁶⁶(直立)向C(垂枝)的同义替换，启动子区有一段 470 bp 的插入/缺失。Pm024074 在垂枝梅花的芽和茎中的表达异常强烈。加权基因共表达网络分析表明，Pm024074 邻近基因与株型显著相关。此外，本研究基于 Pm024074 基因的序列差异开发了一个可靠的单核苷酸多态性标记，可用于梅花垂枝性状的精确标记辅助育种。研究结果为梅花垂枝性状形成的遗传学机制提供了新见解，同时对于树型调控具有潜在应用价值。

关键词：混池转录组测序/ PmUGT72B3 /梅花/UDP-糖基转移酶/垂枝/加权基因共表达网络分析
 

研究背景

株型是园艺植物的研究方向之一。由于木本植物存在环境可塑性强、遗传背景复杂以及世代周期长等特点，致使木本植物株型性状的研究相对滞后，限制了利用分子标记辅助选择育种技术改良木本园艺植物株型。梅花位居中国十大名花之首，有“花魁”之美誉，是我国著名的早春木本观赏植物。垂枝梅因其枝条自然下垂、树姿隽秀、花开如瀑，深受人们喜爱。然而，垂枝梅花品种资源稀缺，垂枝性状遗传机理仍不清晰，极大地限制了垂枝梅花新品种选育进程以及在园林景观中的广泛应用，解析梅花垂枝性状分子遗传调控机制迫在眉睫。

研究方法

为了破译垂枝梅花的遗传信息，前期通过直枝梅品种‘六瓣’和垂枝梅品种‘粉台垂枝’杂交，获得了表型性状分离子代。通过表型性状测量和观察（Fig. 1），筛选极端的20株直枝子代和20株垂枝子代为材料，取其叶芽和嫩茎分别构建混合池开展RNA测序。基于RNA测序数据，利用BSA方法鉴定与梅花垂枝性状相关的QTLs，垂枝梅和直枝梅的差异表达基因(DEGs)，同时利用WGCNA构建了与梅花垂枝性状相关的基因共表达网络。结合梅花品种重测序数据，进一步分析了候选QTL区域垂枝梅和直枝梅的核酸多样性差异。
 

研究结果

1. 垂枝生长性状评价

表型观测显示，垂枝梅叶芽萌发时便表现出下垂状态（Fig. 1a）。将刚长出嫩枝的垂枝梅枝条基部固定，枝条呈现向上生长，而没有固定的对照表现为下垂生长，去顶之后木质化的垂枝枝条不发生弯曲，而新长出的枝条重新出现下垂生长（Fig. 1b）。嫁接实验进一步证明垂枝性状不受来自砧木及直枝梅枝条信号分子传递的影响（Fig. 1c,d）。基于分枝角和下垂角度性状，筛选了极端下垂和极端直立的子代作为后续分析材料（Fig. 1e）。
 

Fig 1. 垂枝表型的观察与评价
 

2. RNA测序及差异表达基因分析

直枝梅和垂枝梅RNA-seq分析结果表明，共注释到24,201个基因，17,456个基因的FPKM>1（Fig. 2a-d），其中495个基因在垂枝梅和直枝梅的叶芽中差异表达，328个基因在嫩枝中差异表达，大量基因在垂枝梅中呈现上调表达趋势(Fig. 2e)。组织表达特异性分析结果表明，276个差异表达基因在叶芽中特异表达，109个DEGs在茎中特异表达(Fig. 2f,g)。
 

Fig 2. 转录组测序数据分析
 

3. 基于WGCNA分析构建基因共表达网络

利用WGCNA方法，鉴定了brown模块中276个基因与梅花垂枝性状显著正相关（相关系数0.96）（Fig. 3a,b），进一步对模块内的基因与垂枝性状进行相关分析，相关系数达0.79 (Fig. 3c)。基因功能富集分析表明，模块内的基因主要与激素代谢、次生代谢和转录调控相关，这些基因在垂枝梅和直枝梅中呈现显著不同的表达模式（Fig. 3d）。
 

Fig 3. 四组样品差异表达基因的加权基因共表达网络分析
 

4. 基于BSR分析定位一重叠的QTL

通过BSR分析，鉴定出5个与梅花垂枝性状显著相关QTLs (Q value < 0.001)（Table 1），其中Pm7-qtl-4位于9.69-10.65 Mb区间，与早期定位的区间部分重叠（Fig. 4a）。核酸多样性分析表明，该区域存在显著的选择性清除(Fig. 4b)。基因表达分析发现该区间存在52个基因，其中仅有4个基因差异表达 (Fig. 4c)。基因功能注释显示，Pm024074基因含有coniferyl-alcohol glucosyltransferase保守结构域，与木质素前体糖基化及形成层生长有关(Fig. 4c,h)。qRT-PCR和组织表达特异性分析进一步验证了Pm024074在垂枝梅叶芽和嫩茎中显著高表达（Fig. 4d-g）。
 

Table 1 利用G’ 方法鉴定到的5个显著相关QTL

Fig 4. 垂枝性状QTL和候选基因鉴定
 

5. 垂枝梅与直枝梅基因型差异分析

基于重测序数据，分析了关键候选基因Pm024074及其侧翼2 kb的SNPs核酸多样性（π）和遗传分化（Fst），在7号染色体10,245,401–10,247,301区域存在显著的差异位点(Fig. 5a)。其中，Pm7_10245464 SNP与垂枝池和垂枝亲本特异关联(Fig. 5b)，该SNP位于Pm024074基因第66个碱基位置，属于T > C同义突变。对235份材料的分型结果显示，该SNP标记与梅花垂枝性状显著相关(Fig. 5c,d)，并将其定义为Pm^W等位。其中，CC基因型的分枝角和下垂角度显著大于TT基因型(Fig. 5e)。
 

Fig 5. Pm024074 基因差异分析
 

启动子序列差异分析显示，垂枝亲本中Pm024074启动子区域存在一段470 bp插入片段，该插入片段包含4个转录因子结合位点(Fig. 6)。对Pm024074基因编码序列进行miRNA靶位点预测，发现Pm^W位点正处于miR838的靶标位置。进一步从杂合的垂枝梅和直枝梅品种中克隆Pm024074基因的全长cDNA，测序结果显示allele C在垂枝梅中特异表达，allele T在直枝梅中特异表达。上述结果证明了Pm024074是调控梅花垂枝性状的一个关键候选基因。
 

Fig 6. 候选基因Pm024074启动子区域缺失片段鉴定
 

6. PmUGT72B3共表达网络

候选基因Pm024074与拟南芥UGT72B3（AT1G01420.1）基因为同源基因，因此将其命名为PmUGT72B3。UGT家族蛋白能够催化糖基，转移特异的受体，影响植物激素与糖和氨基酸的结合。基于共表达分析，进一步从brown模块中提取了与PmUGT72B3共表达的初级和次级关联基因。其中23个基因与次生代谢、激素代谢和转录调控相关，其中包括生长素（Phytochrome-associated protein 1，Pm005182）、赤霉素（Gibberellin 2-oxidase 1，Pm011163)）以及木质素（Transcaffeoyl-CoA 3-O-methyltransferase (CCoAMT), Pm027248)生物过程相关基因（Fig. 7）。
 

Fig 7. Pm024074邻近基因共表达网络分析
 

主要结论

通过BSR-seq方法鉴定到一个等位基因Pm024074 (PmUGT72B3)，包含coniferyl-alcohol glucosyltransferase保守结构域，其与植物激素和木质素合成途径相关。PmUGT72B3基因编码序列第66位碱基发生T>C突变，在垂枝梅启动子区域存在470 bp插入片段，这些差异变化导致Pm024074在垂枝梅中显著高表达，从而引起植物激素和木质素调控过程异常。上述研究有助于理解梅花垂枝性状遗传机制，对木本观赏植物株型改良提供参考。
 

文章链接

原文链接：https://journal.hep.com.cn/fase/EN/10.15302/J-FASE-2020379